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我國黃熱減毒活疫苗中突變毒株情況探究

時間:2019-12-13 來源:中國生物制品學雜志 作者:王玲,劉明磊,房恩岳, 本文字數:6297字

  摘    要: 目的 分析我國黃熱減毒活疫苗的均勻性。方法 采用重量法測定同批疫苗的裝量差異;空斑法測定同批號10支疫苗之間的病毒滴度差異;挑取20個病毒空斑,分析這20個空斑病毒亞克隆株的生長特點和空斑形態的一致性,并選取其中4個亞克隆株進行全基因組序列測定,比對分析不同亞克隆株的基因突變情況。結果 同批黃熱減毒活疫苗裝量差異為-3. 4%~2. 83%;同批號10支疫苗的病毒滴度幾何均數為5. 12 LgPFU/mL,SD為0. 16 LgPFU/mL,CV為3%;20個空斑病毒均在傳代后第5天引起的細胞病變;同一時間收獲的20個空斑病毒的病毒滴度均大于7. 0 LgPFU/mL,CV為2%;20個空斑病毒亞克隆株所形成的空斑與疫苗空斑形態相似;2個空斑病毒未發生任何有義突變,1個空斑病毒發生了1個有義突變(NS5),1個空斑病毒發生了5個有義突變,其中4個位于非結構蛋白,1個位于C蛋白。結論 無論是從裝量差異、病毒滴度差異、疫苗不同空斑病毒亞克隆株表型和基因型的差異,我國黃熱減毒疫苗均表現出了良好的均勻性。

  關鍵詞: 黃熱減毒活疫苗; 裝量; 病毒滴度; 空斑; 全基因組序列; 均勻性;

  Abstract: Objective To analyze the homogeneity of live attenuated yellow fever vaccine in China. Methods The difference in filling volumes of vaccine of the same batch was determined by gravimetric method,while that in the virus titers of 10 containers of vaccine of the same batch by plaque method. Twenty viral plaques were selected and analyzed for the growth characteristics of subclones and the morphology,from which four subclones were selected for complete genome sequencing. The gene mutations of various subclones were compared. Results The difference in filling volumes of live attenuated yellow fever vaccine of the same batch was-3. 4% ~ 2. 83%. The geometric mean of viral titers of 10 containers of vaccine was 5. 12 LgPFU/mL,with a SD of 0. 16 LgPFU/mL and a CV of 3%. All the 20 plaque viruses caused cytopathic changes of  on the 5 th day after subculture. All the viral titers of 20 plaque viruses harvested at the same time were more than 7. 0 LgPFU/mL,with a CV of 2%. The plaques formed by the 20 subclones of plaque virus were similar in morphology to those by the vaccine. No sense mutations were observed in two plaque viruses,while one sense mutation(NS5) was observed in one plaque virus. However,five sense mutations were observed in one plaque virus,of which four were located in non-structural protein and one in C protein. Conclusion The live attenuated yellow fever vaccine in China showed good homogeneity in terms of filling volume,virus titer as well as phenotype and genotype of different plaque virus subclones.

  Keyword: Live attenuated yellow fever vaccine; Filling volume; Virus titer; Plaque; Whole genome sequence; Homogeneity;

  黃熱病是由黃熱病毒(yellow fever virus,YFV)引起,主要通過伊蚊叮咬傳播的自然疫源性傳染病,以高熱、頭痛、黃疸、蛋白尿和出血等為主要臨床表現。全球約有45個非洲和南美洲國家總計超過9億人口處于黃熱病疫區內,每年黃熱病病例估計有20萬。2016年,黃熱病疫情在安哥拉暴發,并很快向全球播散,亞洲、歐洲和美洲均出現了輸入性病例[1],我國也首次出現了輸入型黃熱病病例[2]。

  疫苗接種是目前唯一經濟有效的黃熱病防治措施,尤其對于控制疫區黃熱病流行和預防旅行者感染十分重要。17D疫苗是世界范圍內廣泛使用的也是唯一的黃熱病疫苗,全世界所有用于黃熱病疫苗生產的毒種均來自野毒株Asibi株。將該病毒經腹腔接種、蚊子叮咬、皮下接種、感染蚊子懸液注射等方法在猴體內連續傳54代,再在鼠全胚中傳18代,雞全胚中傳58代,去除腦和脊髓的雞胚中連續傳代至第180代,獲得17D原始減毒疫苗株[3]。隨后該減毒株繼續在雞胚中連續傳代,不同代次水平的毒種流傳到不同國家用于黃熱病疫苗生產。目前,用于黃熱病疫苗生產的17D毒株為17DD、17D-204以及WHO選用毒株17D-213[4]。
 

我國黃熱減毒活疫苗中突變毒株情況探究
 

  我國黃熱減毒活疫苗生產用毒株為17D-204衍生株,為我國著名學者湯飛凡院士于1947年從美國洛克菲勒基金會帶回,后在雞胚中連續傳54代,作為工作毒種。相比其他黃熱病疫苗生產毒株,我國黃熱疫苗生產毒株代次要高50代左右。黃熱病疫苗為減毒活疫苗,多次傳代可能會引起核苷酸突變增多,病毒株的純度也可能會降低,甚至可能會出現毒力相關位點的回復突變,疫苗株毒力返祖的情況。《中國藥典》對疫苗生產用毒種采用三級庫管理,對疫苗毒種代次要求極為嚴格,尤其是減毒活疫苗。我國黃熱減毒活疫苗質量標準以及WHO TRS978均要求對疫苗生產用工作種子批進行全基因組測序或至少關鍵蛋白基因測序[5,6]。

  本研究對我國黃熱減毒活疫苗的均勻性、一批疫苗中是否存在突變毒株、突變毒株的生物學性狀是否改變及其對該批疫苗安全性的影響進行分析,現將結果報道如下。

  1、 材料與方法

  1.1、 疫苗及細胞

  黃熱減毒活疫苗(批號:20180402)由北京生物制品研究所有限責任公司提供;Vero細胞為中國食品藥品檢定研究院蟲媒病毒疫苗室保存。

  1.2、裝量差異測定

  隨機抽取10支黃熱減毒活疫苗,逐支除去標簽、鋁蓋,一一標記后,小心開啟膠塞,使容器內外氣壓平衡,蓋緊后,分別置于萬分之一天平內精密稱量瓶與內容物的總重量(W1)。傾出內容物,用水清洗容器,置于烤箱內干燥后,再分別一一精密稱量容器的重量(W2)。計算每支疫苗的裝量(W)(W1-W2)及10支疫苗的平均裝量。將每支疫苗裝量與平均裝量相比較,計算同批次疫苗的裝量差異。

  1.3、 病毒滴度差異測定

  隨機抽取10支黃熱減毒活疫苗,采用空斑法測定每支疫苗的病毒滴度。將Vero細胞按8×104個/m L的密度接種6孔細胞培養板,每孔4 mL,37℃,5%CO2培養箱中培養48 h;將10支黃熱減毒活疫苗分別按照標示量復溶后,進行4倍系列稀釋,取1∶1 024、1∶4 096、1∶16 384、1∶65 536稀釋度的疫苗,接種于長滿單層Vero細胞的6孔板中,每孔0.4 mL,每個稀釋度接種2孔,37℃,5%CO2吸附60 min;加入甲基纖維素覆蓋物,4 mL/孔,37℃,5%CO2孵箱內培養7 d;吸棄6孔板中的覆蓋物,加結晶紫染色液,每孔1 mL,染色15~20 min;棄去染色液,用流水沖洗培養板,計數每支疫苗每個稀釋度每孔的蝕斑數,計算疫苗的病毒滴度。

  1.4、 病毒株空斑病毒亞克隆的挑選

  將Vero細胞按8×104個/m L接種6孔細胞培養板,每孔4 mL,37℃,5%CO2培養箱中培養48 h;將黃熱減毒活疫苗4倍系列稀釋,取1∶1 024、1∶4 096、1∶16 384、1∶65 536稀釋度的疫苗接種于長滿單層Vero細胞的6孔板中,每孔0.4 mL,每個稀釋度接種4孔,37℃,5%CO2孵箱內吸附1 h;加入甲基纖維素覆蓋物,4 mL/孔,37℃,5%CO2孵箱內繼續培養7 d;在生物安全柜內去除板孔中的甲基纖維素,肉眼挑取板孔中單個獨立的病毒空斑,共計20個,分別編號為YFV1~YFV20。

  1.5、 空斑病毒亞克隆株的培養及生長特性初步觀察

  將挑取的20個空斑病毒亞克隆各經1 mL病毒稀釋液重懸混勻后,分別接種至已長成單層的Vero細胞(T25細胞培養瓶)上,繼續于37℃,5%CO2孵箱內培養,逐日觀察并記錄每個亞克隆的細胞病變(CPE)情況。當CPE出現莘時,收獲相應的亞克隆病毒株,于-70℃凍存備用。

  1.6 、20個空斑病毒亞克隆株的病毒滴度測定

  將收獲的20個空斑病毒亞克隆株分別進行4倍系列稀釋,各取1∶1 024、1∶4 096、1∶16 384、1∶65 536四個稀釋度的亞克隆株,按1.3項方法測定病毒滴度。染色后,計數每個亞克隆病毒株、每個稀釋度、每孔的蝕斑數,計算每個亞克隆株的病毒滴度。

  1.7、 4個空斑病毒亞克隆株的全基因組序列測定及比對

  選取編號為YFV5、YFV10、YFV15、YFV20的4個亞克隆病毒株,按表1中引物序列及擴增條件,將全基因組序列分9段擴增,PCR產物回收后送英濰捷基(上海)貿易有限公司測序。利用DNASTAR軟件中的SeqMan模塊進行每個亞克隆株的全基因組序列拼接,并用其中的MegAlign模塊進行4個亞克隆株的全基因組序列比對。引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成。

  表1 黃熱減毒活疫苗毒株全基因組測序用引物序列
表1 黃熱減毒活疫苗毒株全基因組測序用引物序列

  2、 結果

  2.1 、同批次疫苗的裝量差異

  該批次黃熱減毒活疫苗的平均重量為0.031 8 g,標準差(SD)為0.000 7 g,變異系數(CV)為2.1%,裝量差異為-3.4%~2.83%。最小重量與最大重量的差值為0.002 g,見表2。

  2.2、 同批次疫苗的病毒滴度差異

  10支同批次黃熱減毒活疫苗的病毒滴度分別為5.00、4.90、5.05、5.28、5.31、5.37、5.06、5.12、5.20、4.97 LgPFU/mL,幾何均數為5.12 LgPFU/mL,SD為0.16 LgPFU/m L,CV為3%。病毒滴度最大值與最小值之差為0.47 LgPFU/mL。

  2.3、 20個空斑病毒亞克隆株的培養及收獲

  CPE效應觀察發現,第3天有12個亞克隆株CPE達+,第4天CPE可達+~荻,第5天20個亞克隆株的CPE均達莘。因此,于第5天收獲挑取的20個天壇株亞克隆株。

  表2 10支同批次黃熱減毒活疫苗的裝量差異
表2 10支同批次黃熱減毒活疫苗的裝量差異

  2.4、 20個空斑病毒亞克隆毒株的病毒滴度及空斑形態

  20個亞克隆株的病毒滴度分別為7.16、7.37、7.20、7.28、7.06、7.19、7.28、7.11、7.14、7.45、7.42、7.46、7.26、7.15、7.43、7.57、7.13、7.39、7.23、7.44 LgPFU/mL,幾何均數為7.28 LgPFU/mL,SD為0.15,CV為2%,最高滴度與最低滴度的差值為0.51 LgPFU/mL。20個空斑病毒亞克隆株所形成的空斑形態相似:空斑較小,邊緣清晰,大小均勻。其中,YFV5、YFV10、YFV15、YFV20四個亞克隆株所形成的空斑形態見圖1。

  圖1 天壇株亞克隆株的空斑形態圖
圖1 天壇株亞克隆株的空斑形態圖

  Fig 1.Plaque morphology of subclones of Tiantan strain

  A~D:分別為YFV5、YFV10、YFV15、YFV20亞克隆株的空斑。

  2.5、 4個空斑病毒亞克隆株的全基因組序列及與疫苗株的比對分析

  YFV5、YFV10、YFV15、YFV20四個亞克隆株分9段進行PCR擴增,均擴增出目的基因片段,見圖2。與GenBank中提交的該疫苗株基因序列(FJ654700)相比,YFV15與YFV20亞克隆株未發生有義突變;YFV5亞克隆有5個有義突變,1個有義突變在C蛋白上,其他4個有義突變均在非結構蛋白;YFV10亞克隆株僅有1個有義突變,在非結構蛋白NS5上。見表3。

  圖2 空斑病毒亞克隆株全基因組分段擴增電泳圖
圖2 空斑病毒亞克隆株全基因組分段擴增電泳圖

  Fig 2.Electrophoretic profile of segmental amplification product of whole genome of plaque virus subclones

  M:DNA marker;1~9:9段PCR擴增產物。

  表3 4個空斑病毒亞克隆株與疫苗株的全基因組序列比對分析
表3 4個空斑病毒亞克隆株與疫苗株的全基因組序列比對分析

  注:粗體處為突變的核苷酸。

  3、 討論

  17D疫苗是世界范圍內廣泛使用的也是唯一的黃熱病疫苗,被認為是迄今為止最安全有效的疫苗之一。目前用于黃熱病疫苗生產的3個17D亞株17DD、17D-204以及WHO選用毒株17D-213,實際為經不同傳代方式獲得的不同代次的17D株,是未經蝕斑純化的,均為含有不同大小蝕斑毒株或基因變異株的異源性亞群[7]。17D疫苗的蝕斑變異株的相對比率隨著傳代培養而變化[8]。

  雖然我國黃熱疫苗生產毒株相比其他黃熱病疫苗生產毒株代次要高50代左右,但從近70年100多萬劑的使用情況來看,無嚴重不良反應報道,疫苗的安全性值得信賴。為了更好地評價我國黃熱減毒活疫苗的安全性,本研究對該疫苗的均勻性進行了分析。

  裝量均勻性良好,是一批疫苗質量均勻的基礎。從最基本的裝量差異結果來看,同批疫苗裝量的CV僅為2.1%,對平均重量僅為0.031 8 g的疫苗產品來說,我國黃熱減毒活疫苗裝量均勻性良好,這也為同批疫苗不同支間的滴度均勻奠定了良好的基礎。采用經典的黃熱病疫苗滴度測定方法—空斑法測定了10支同批次黃熱減毒活疫苗的病毒滴度,結果顯示,CV僅為3%,最大值與最小值之差僅為0.47 LgPFU/mL,表明病毒滴度均勻性良好。為進一步研究疫苗中黃熱病病毒的表型和基因型的均勻性,挑取20個病毒空斑進行生長趨勢及空斑形態初步分析,結果顯示,20個空斑病毒的生長趨勢基本一致,均可在傳代后的第5天引起莘的細胞病變,而同一時間收獲的20個空斑病毒的病毒滴度均大于7.0 LgPFU/mL,CV為2%,且20個空斑病毒亞克隆株所形成的空斑形態相似,與疫苗空斑形態基本一致。對其中4個空斑病毒亞克隆株進行全基因組序列測定比對分析,結果有2個空斑病毒亞克隆株未發生任何有義突變;而發生有義突變的兩個亞克隆株,共6個有義突變,其中有5個有義突變在非結構蛋白上,僅1個在結構蛋白—C蛋白上。該基因序列比對結果也基本印證了空斑病毒的表型一致性。由此可見,雖然我國黃熱減毒活疫苗代次偏高,但無論從裝量差異、病毒滴度差異、疫苗不同空斑病毒亞克隆株表型和基因型的差異,我國黃熱減毒疫苗株均表現出了良好的均勻性。17D疫苗株的高遺傳穩定性也再一次被印證。該結果也與XIE等[9]的研究結果一致,他們分析了自17D-204疫苗接種者體內分離的17D病毒株的基因序列,發現結構基因無變異發生,僅NS5發生2個有義突變;分離并分析猴體腦內接種17D-204疫苗12 d后血清所得的病毒株,未發現有義突變。

  與其他逆轉錄病毒相比,17D疫苗株具有較高的遺傳穩定性,這也是單一病毒株(17D)這么多年來能夠發揮疫苗作用的關鍵所在。但17D疫苗株是未經蝕斑純化的異源性亞群,17D疫苗為準種混合制劑,同源序列分析證明,17D疫苗存在12個氨基酸的異質性,包括結構性和非結構性基因以及3′端編碼區域[10]。但也有研究認為,基因型和表型的異源性改變可能不會影響17D疫苗的安全性,對疫苗可能具有積極作用[11]。無論怎樣,均需密切關注黃熱病疫苗的均勻性,尤其要關注生產用毒株的異質性變異,表型和基因型的變化,從多方面進行疫苗毒株的安全性研究,提高疫苗毒株的質量控制標準,切實保障黃熱病疫苗的使用安全。

  參考文獻

  [1] WILDER-SMITH A,MONATH T P. Responding to the threat of urban yellow fever outbreaks[J]. Lancet Infect Dis,2017,17(3):248-250.
  [2] LING Y,CHEN J,HUANG Q,et al. Yellow fever in a worker returning to China from Angola,March 2016[J]. Emerg Infect Dis,2016,22(7):1317-1318.
  [3] LLOYD W,THEILER M,RICCI N I. Modification of the virulence of yellow fever virus by cultivation in tissues in vitro[J].Transact Royal Soci Trop Med&Hyg,1936,29(5):481-529.
  [4] ROBERTSON S E. The immunological basis for immunization. 8.Yellow fever[M]. Geneva:WHO Document WHO/EPI/GEN/93.18,1993.
  [5]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2015年版第一增補本[S].北京:中國醫藥科技出版社,2018:323-325.
  [6] WHO. Recommendations to assure the quality,safety and efficacy of live attenuated yellow fever vaccines[J]. WHO TRS,2010,978:267.
  [7] GOULD E A,BUCKLEY A,CANE P A,et al. Use of a monoclonal antibody specific for wild-type yellow fever virus to identify a wild-type antigenic variant in 17D vaccine pools[J]. J General Virol,1989,70(7):1889.
  [8] LIPRANDI F. Isolation of plaque variants differing in virulence from the 17D strain of yellow fever virus[J]. J General Virol,1981,56(2):363-370.
  [9] XIE H,RYMAN K D,CAMPBELL G A,et al. Mutation in NS5 protein attenuates mouse neurovirulence of yellow fever17D vaccine virus[J]. J General Virol,1998,79(4):1895-1899.
  [10] PUGACHEV K V,OCRAN S W,GUIRAKHOO F,et al. Heterogeneous nature of the genome of the ARILVAX yellow fever17D vaccine revealed by consensus sequencing[J]. Vaccine,2002,20(7):996-999.
  [11] BARRETT ADT. Yellow fever vaccines[J]. Biologicals,1997,25(1):17-25.

    王玲,劉明磊,房恩岳,劉晶晶,李玉華.我國黃熱減毒活疫苗的均勻性分析[J].中國生物制品學雜志,2019,32(11):1201-1205.
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